宇宙航空環境医学 Vol. 43, No. 3, 123-129, 2006

原著

金魚の迷路摘出による眼球運動の変化から考える耳石器官の働き

岩田 香織¹，高林 彰²，森 滋夫³

¹藤田保健衛生大学大学院医学研究科
²藤田保健衛生大学衛生学部
³名古屋大学名誉教授

Analysis of Eye Movements of Goldfish after Hemilabyrinthectomy

Kaori Iwata¹, Akira Takabayashi¹ and Shigeo Mori²

¹Graduate School of medicine, Fujita Health University
²School of Health Sciences, Fujita Health University
³Nagoya University

ABSTRACT
  On Earth, the otolith organ responds to linear acceleration and gravity and plays an important role in adjusting the posture or eye movements for tilting the head or translation. In microgravity, static tilt will no longer cause a change in the otolith organ, which subsequently impairs spatial behavior with characteristic deficits in posture and locomotion. However, linear acceleration continues to be transduced. As a result, the central nervous system must adapt to the absence of certain signals and reinterpret others. In contrast, a unilateral vestibular lesion causes deficits in posture and eye movements. The subsequent recovery with time is usually termed vestibular compensation. We are interested in the relationship between space adaptation and vestibular compensation. In this study, we investigated the vestibular compensation of eye movements after unilateral lesion of utriculus in goldfish. Torsional eye movements evoked by body tilting were analyzed for three months after unilateral removal of the otolith organ. We video recorded eye movements with CCD cameras attached to both sides of a fish tank. The torsional eye rotation angles of the right and left eyes were calculated from the images digitized by a computer.
  Normal fish exhibited larger torsional eye movements for head-down tilting than for head-up tilting. No spontaneous nystagmus was observed in the goldfish following recovery from hemilabyrinthectomy surgery（a period of 30 minutes). Unilateral removal of the otolith resulted in a decrease in response amplitude of both eyes to approximately 50% of normal. However, the specific response characteristic of torsional eye movement for head-down tilting being larger than that for head-up tilting was maintained during compensation. This result suggested that the utricular organ had more sensitivity for head-down than for head-up. Although the response amplitude increased to approximately 70% of normal after two weeks, it did not recover its normal value after three months of compensation. The vestibular compensation was divided into two processes: the early（fast）and later（slow）recoveries. This suggested that the vestibular compensation of torsional eye movements was attributed to increased neural activity and to plasticity in the central nervous system.

  (Received: 7 November, 2005 Accepted: 1 September, 2006)

  Key words: goldfish, vestibular compensation, otolith, torsional eye movement

はじめに
  生体が宇宙の微小重力に暴露された時，最初は種々の生理機能に変調を生じるが，時間の経過とともに，宇宙での基準あるいは地上の基準に順応する^4）。微小重力環境に暴露された時，地上の環境と比較して最も大きな変化は前庭器官への入力の変化，特に耳石器官への入力の消失である。地上における耳石器官は直線加速度と重力加速度の検出器として機能し，頭部の傾斜あるいは並進運動刺激に対する姿勢や眼球運動の調節に重要な働きを行っている。一方，微小重力環境では耳石器官への重力加速度成分の消失にもかかわらず，直線加速度成分は受容可能であり，半規管による回転加速度の受容，視覚や体性感覚は何らかの変容を受け地上とは異なった感覚を生じ，これが姿勢調節や眼球運動の変調を誘発する可能性が示唆されている。微小重力環境暴露の初期にみられる宇宙酔いもこれらの感覚の間に生じる混乱がその原因であると考えられている^3）。宇宙酔いは，地上の動揺病と類似の症状を示すが，異なるメカニズムであることが示唆されており原因には未だに不明な点が多い。しかし，この宇宙酔いが起こるのは，地上から微小重力空間に行った初日に起こりやすくその後，数日で順応し症状が改善されることから宇宙順応症候群（Space Adaptation Syndrome; SAS）とも呼ばれる。
  金魚が宇宙の微小重力に暴露された時，最初は異常な行動を示すが，時間の経過とともに，感覚―運動系の順応が生じ，適切な姿勢運動の機能的調節が行われる^8）。微小重力におけるこの動物の姿勢や行動の変調が直接宇宙酔いと同一かどうかは明確ではないが，順応を示す過程には共通点があると考えられる。一方，地上の重力環境においても，前庭器破壊後に見られる回復過程，いわゆる前庭代償が知られている^7，10）。我々は，前庭代償が宇宙順応と関連があると考えこの2つの関係に興味を持っている。片側前庭破壊による症候群は多くの異なった症状からなり，それぞれは，同側の前庭迷路感覚器や感覚器群の神経切断の結果である。異なった症候群が異なった経過で消失することは，異なった回復機序が含まれていることを示唆する^7）。典型的には，姿勢や眼球平衡における静的非対称性は前庭反射の特性における動的非対称より容易にまたより完全に代償される。金魚の片側耳石器官摘出後，静的症状は術側への傾斜傾向を除いて，30分以内に消失する。代償過程は背光反応を指標として調べる限り，24時間以内に始まる早い過程とその後の遅い過程に分けられ，金魚では背光反応の最大傾斜角度の減少傾向は2〜3週間続いたことが報告されている^{1，2，5，6，9）}。宇宙順応は前庭感覚入力の変化，特に耳石器官への重力加速度の消失であるが，前庭代償では前庭受容器が破壊されている点が最も大きい差異である。しかし，その後の順応過程においては，前庭感覚以外の視覚や体性感覚が関与し，さらには中枢神経系の再構成が推定される点が共通するところである。
  本研究では，金魚の片側耳石器官摘出後に体傾斜で誘発される回旋眼球運動を指標として前庭代償過程を解析した。


方法
  実験には市販されている体長8〜10 cm，体重10〜15 gの和金（Carassius auratus）を12匹用いた。12匹のうち術後3ヶ月まで生存したのは7匹であった。飼育は，1個の水槽（30×20×20 cm）に金魚を2〜3匹づつ入れ調節を行わない通常の研究室の室温（20〜25℃），照明の状態で飼育を行った。本実験には正常金魚と，片側耳石器官摘出手術を行った金魚を用いた。
耳石器官摘出手術は金魚を麻酔薬（4万倍希釈したMS222液）に入れ，麻酔が効いたことを確認したのち固定装置に金魚を固定し，頭部をマーキュロクロムで消毒，さらに表面麻酔を行った。その後，耳石器官周辺に穴をあける位置を決め，表皮をメスで取り除き頭骨に電動ドリルで穴をあけ，傷口を綿球できれいにした。脳室内の脂肪を少量取り除き，卵形嚢の位置に目印をつけ，ピンセットを小孔に刺入して，卵形嚢を摘み上げた。このとき，三半規管も破壊された。傷口を骨蝋でふさぎマーキュロクロムで消毒した。手術にはおよそ15分を要した。その後，金魚を固定装置からはずして観察用水槽へ移し行動を観察し，耳石器官摘出から30分経過した後，実験用水槽に移した。今回は左側耳石器官のみの摘出を行った。
  金魚の固定は，金魚をガーゼに包み左右から挟み込む状態で実験水槽へ固定した。また，金魚の口に小さな管を根元まで密着させ咥えさせることにより金魚が鰓呼吸を出来るようにした。実験水槽中の金魚の頭上に発光ダイオード（LED）を取り付け，刺激が加えられると点灯する仕組みとし，画像に刺激のタイミングを写し込んだ。実験用水槽内は，酸素水で満たし，気泡は注射筒を用いてできるだけ除去した。回旋眼球運動の記録は，金魚の両眼前に固定したビデオカメラで行った。この時，LEDも眼球運動と同時記録できるカメラアングルとした。撮影するための照明の明るさは1000 lxとした。
  重力加速度を変化させるため傾斜刺激装置を用いた。傾斜刺激装置は傾斜角度，静止時間，傾斜速度，傾斜方向をN88Basicでプログラミングすることによってモーター制御した。今回は，傾斜角度は60度，傾斜スピード90度/秒，静止時間5秒で金魚の体軸に対し頭部上昇（Head Up）と頭部下降（Head Down）の傾斜刺激を3回繰り返した。また，この傾斜方向（体軸0度）から左右にそれぞれ15度体軸方向を偏倚（体軸−15度，体軸15度）させて傾斜刺激を行うことによって，耳石器官に加わる重力加速度の方向を変化した時の回旋眼球運動の記録も行った。
  実験を行ったのは，正常時，片側耳石器官摘出後30分，1日，3日，1週間，2週間，1ヶ月，2ヶ月および3ヶ月である。両眼前に固定したビデオカメラの画像を用いて眼球回旋角度を求めた。解析方法は，記録したビデオ画像からLEDの点灯を目印に刺激開始のタイムコードを読み取り，刺激開始より3秒前からの画像をキャプチャーし，パーソナルコンピューターでフレーム（0.03秒/フレーム）ごとに解析した。眼球上に2点の目印を決め，それを結ぶ直線から回旋角度を求めた。ビデオ画像での眼球の反時計方向の回転を正の値，時計方向の回転を負の値で表記した（Fig. 1）。

Fig.　1. Analysis of torsion angle (A）Method to calculate torsion angle.,　 （B）One frame of video image used to obtain the torsion angle.

結果
  Fig. 2に回旋眼球運動の時間的変化の1例を示した。体軸0度時のHead UpとHead Downの傾斜刺激に対する，正常時と片側耳石器官摘出30分後の，右眼，左眼の回旋眼球運動を区別して示した。水平位置からHead Up傾斜すると，右眼は時計回り（-），左眼は反時計回り（+）に回転し，Head Down傾斜に対して，右眼は反時計回り（+），左眼は時計回り（-）に回転した。この眼球回旋方向は，頭部の傾斜に対して視線を維持しようとする代償性の反対回旋である。正常時と比較して片側耳石器官摘出30分後では回旋眼球運動が右眼，左眼共に減少した。また，Head Down傾斜に対する回旋眼球運動のほうがHead Up傾斜時に比べ大きかった。傾斜刺激に対する回旋角度の大きさを，傾斜刺激を加える前の水平時での回旋角度と，傾斜刺激後の静止状態での回旋角度との差を振幅として求めた。

Fig.　2. Time course of torsional eye movements (A）Left eye responses for Head Up.  （B）Right eye responses for Head Up., （C）Right eye responses for Head Down.,  （D）Left eye responses for Head Down. Thin lines indicate responses for each body tilting of 60 degrees, and thick lines indicate the average of these three responses.

Fig. 3に左耳石器官摘出後の回旋眼球運動の傾斜刺激に対する振幅の経時的変化を示した。左耳石器官摘出30分後から，日が経つにつれ回旋角度が正常時の回旋角度に近づくように増大した。しかし，3ヶ月経っても正常値までは回復しなかった。Fig. 3の代償過程の経過が指数関数的に変化しているように見えるので，その時定数を求めた。左耳石器官摘出後の回旋眼球運動が正常値に達するまで回復すると仮定し，正常値との差の自然対数をプロットしその直線の傾きから時定数が計算できる。Fig. 4にHead Up，Head Down傾斜刺激に対して，それぞれ左眼，右眼の変化の様子を示した。3ヶ月にわたって単一の直線で近似することは不可能で，少なくとも，術後30分から術後14日（術後2週間）までの早い回復過程と術後14日（術後2週間）以降の遅い過程に分かれた。傾斜方向の体軸を微小に偏倚（±15度）させることによって，回旋眼球運動がどのように変化するかを調べた。傾斜の体軸を変化させる事は，卵形嚢への重力加速度入力を変化させる事を意味する。術後3ヶ月での回旋眼球運動の振幅を各体軸ごとにFig. 5に示す。正常時にも観察されたHead Down時の方がHead Up時より回旋角度が大きい傾向が術後3ヶ月でも観察された。

Fig.　3. Process of vestibular compensation in torsional eye movements after left otolith removal?Each data were obtained by averaging the responses of 7 fish.

Fig.　4. Changes of torsion angle recalculated in natural logarithm （A）Left eye responses for Head Up.,（B）Left eye responses for Head Down. （C）Right eye responses for Head Up.（D）Right eye responses for Head Down.

Fig.　5. Amplitude of torsional eye movements for three different body axes three months after otolith removal

考察
  左側耳石器官を摘出することにより生じる，手術後30分の安静時の症状は過去の実験結果と同じであった^1，8）。つまり，術側の筋緊張による屈曲と術側への体傾斜あるいは回転，両眼の術側への回転つまり左眼の視線は腹側へ右眼の視線は背側へ偏倚する。また，眼振は観察されず，回旋方向の眼球偏倚も認められなかった。しかし，左側耳石器官を摘出することにより左右それぞれの回旋眼球運動の傾斜に対する反応は減少する。卵形嚢を摘出する際には，半規管の損傷は避けられなかった。このことは，術後の傾斜中あるいは傾斜直後の動的特性の変化として眼球運動に現れていると考えられた（Fig. 2）。今回は，耳石器官の特性を調べるため，傾斜後の安定した部分の振幅を計測した。
  金魚の回旋眼球運動は，前後方向（pitch）傾斜に対して最も大きな反応を示す。今回は，魚の前後方向傾斜による耳石器官刺激と回旋眼球運動の関係から耳石器官の特性について考察した。正常金魚の眼球回旋角度は，Head Up傾斜よりHead Down傾斜時の方が大きかったが，片側耳石器官摘出後でもこの傾向は保たれたままであった。さらに，金魚を体の長軸に対して左右それぞれに15度偏倚させて傾斜刺激を行ってもこの傾向は維持された。これらの結果は，左側耳石器官を摘出することにより，少なくとも手術後30分は右側耳石器官のみが機能した時の回旋眼球運動と考えられ，片側耳石器官の摘出は左右の平衡にはかなりの影響を与えるが，前後の平衡には，量的変化は与えるものの，定性的にはその特徴が保たれることを意味している。このことから有毛細胞分布とその方向依存性は，左右の耳石器官では前後方向の刺激に対する特性はほぼ同一であると推定された。つまり，回旋眼球運動に対しては，前方への加速度刺激に対する感度が後方への加速度刺激に対する感度より高いと考えられた。このことは，回旋眼球運動に関与する外眼筋の特性とも考えられるが，宇宙の微小重力環境で観察されたルーピング行動が常にHead Up方向（背を内側にする回転行動）だったこと等から^8），卵形嚢の特性が前後方向に一様でないことを意味していると考えられた。
  また，片側耳石器官摘出後，回旋眼球運動の振幅は正常時での回旋眼球運動の振幅に近づいていった。しかし，3ヶ月が経過しても回旋眼球運動の反応は正常時の反応の大きさに戻らなかった。残された片側のみの耳石器官の働きにより補える回旋眼球運動には，限界があると示唆された。
  片側耳石器官摘出後の眼球回旋運動の代償過程は，指数関数的に正常値に向かって回復しているように見えた。この回復過程は，金魚の背光反応で見た前庭代償過程と類似している（Fig. 3)^1）。この推定に基づいて眼球回旋角度の自然対数を計算することによって時定数を求めた。その結果，術後2週間までの代償過程の速度が速い期間と，その後の遅い期間とに分けられた。初期の急性代償期では，破壊された前庭器官が再生された証拠はなく，残存する片側の前庭器からの入力を中枢神経系が処理し眼筋に信号を伝達することによって，回旋眼球の反応を生じる。この時，背光反応などの代償過程では視覚や体性感覚等も関与すると考えられている。今回の実験では，視覚入力遮断などの術後の飼育条件を変えた場合は行っていなので不明である。今後検討の必要がある。今回の実験では，眼球回旋角度は，Head Up傾斜よりHead Down傾斜時の方が大きい傾向が術後でも保たれままであったことは，この特徴が両側の耳石器官入力の相互作用ではなく，一つの卵形嚢耳石器官本来の特徴である事を推測させる。術後2週間以後の長期にわたる遅い代償過程は，残された正常耳石器からの入力と入力切断された前庭核の間の相互作用における，中枢神経系の再構築が行われるより時間のかかる変化と考えられた。
  前庭代償過程は前庭器の破壊後の順応であるのに対して，宇宙での前庭順応は，前庭器は健常な状態を保持しつつも，入力環境の変化，特に重力加速度の消失後の順応である点が最も異なるところである。しかしながら，前庭器からの入力情報の変化に対して平衡を回復し，種々の刺激に対してして正常な反応を引き起こすように変化することには共通点も多いと考えられる。初期の急速前庭代償過程では器官や組織などの器質的変化は生じていなく，種々の感覚情報を効果器に伝達する神経活動の再構成の時期であると考えられる。宇宙順応では，宇宙酔いや魚の異常行動などはこの時期に発症し，2週間以内に消失する^3，4，8）。今回観察された回旋眼球運動における初期の前庭代償過程は，この間の宇宙順応と時間的には共通点がある。しかし，耳石器官摘出後の前庭代償では，この間に完全に回復するわけではなかった。急速代償期の後の遅い回復過程ではシナプスの増加を含む器質的変化が生じていると考えられているが^7），今回の回旋眼球運動に関連する中枢神経系でも同様なことが起きていると推定された。これは今後の研究課題である。さらに，実験的興味としては，地上で十分な前庭代償をした動物を微小重力環境に暴露した時の眼球運動の解析を行うことである。宇宙の微小重力に暴露された時，金魚は片側耳石器官摘出後30分に観察された姿勢や行動を示した^8）。眼球運動も同様な現象を示すか，興味のあるところである。


まとめ
  ■眼球回旋角度はHead Up傾斜よりHead Down傾斜時の方が大きかった。
  ■術後時間経過とともに回旋角度が大きくなったが3ヶ月経っても正常値に戻らなかった。
  ■術後でもHead Down時の眼球回旋角度がHead Up時より大きい傾向は保たれた。
  ■前庭代償過程は約2週間までの速い過程とその後の遅い過程の2段階に分けられた。
  ■卵形嚢は，長軸方向の傾斜刺激による回旋眼球運動に対する方向依存性は不明確であった。

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